果树苗木无毒苗的培育

果树苗木无毒苗培育果树苗木病毒病多通过嫁接感染。病毒一旦侵入树体，在自然条件下将永远保存在树体中，无法消灭。根据果树苗木病毒病及其病毒样病害的传染、传播和发病特点，国内外普遍的防治策略是使用脱毒或抗病毒的繁殖材料，严格植物检疫，清除和限制传染源，预防和控制传染。有毒昆虫载体。果树苗木嫁接繁殖时，如果母本树带病毒，势必将病毒传给新繁殖的苗木。目前，在栽培的果树苗木中，部分品种已全部被病毒感染，患上病毒病。为了避免病毒病的危害，必须去除病树中的病毒，使其无病毒。这是防治果树苗木病毒病的第一步。

获得脱毒母本树的方法主要有3种。第一种方法是从果园中选择品种纯正、多年树势旺盛、品质丰产的单株。经病毒检测，确认无病毒后方可获取母本树；对于母本树，通常采用两种方法：热处理结合茎尖培养和茎尖生长点培养；第三种方法是引进国外脱毒品种。

果树苗木热处理脱毒是生产中应用最早、应用最广的脱毒方法。在果树育苗生产中，这项技术已经非常成熟，已经培育出许多单株脱毒果树育苗。然而，茎尖组织培养技术要求高，比热处理困难得多。但对于不能或难以通过热处理去除的病毒，可采用茎尖培养或热处理与组织培养相结合的方法获得无病毒个体。此外，最近发展起来的微移植技术被应用于获得无病毒个体，引起了广泛关注。获得无病毒疫苗。

1.热处理解毒

早在100 多年前，苏格兰园丁就开始利用热量来治疗植物病害。 1923年，一种通过温汤处理从甘蔗中去除病毒，成为病毒病中最早去除病毒的成功范例。在果树苗木方面，1936年至1941年间，相继对桃灌木病、桃黄化病、假桃病等采用热处理，主要是通过温汤浸泡获得解毒成功。其中，针对桃簇病毒，不仅温汤，高温空气处理也取得了成功。同时设计了处理装置，探索了热风处理方法。即调节空气温度在30~40^0之间，并进行一定时间的处理，以达到排毒的目的。自1950年马铃薯卷叶病毒通过热处理成功脱毒以来，迄今为止，除黄化病毒外，许多其他病毒的脱毒也取得了成功。常绿果树苗木病毒病热处理成功解毒的实例主要有柑橘快腐病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘豆类病毒、柑橘断叶病毒等。

热处理方法有两种，一种是温汤浸渍和高温蒸汽处理，另一种是高温空气处理。

(1)温汤浸泡和高温蒸汽处理

通常应用的有50551处理10501!^、5^：处理15}1或35cC处理3040h等温度-时间组合。特别是不耐热的病毒，有时在4045^：处理5301111或30^：处理34即可解毒。树的一部分。因为温汤处理对植株的伤害很大，有时植物组织会被闷死或被水浸湿，所以果树热处理时，通常只处理接穗；而高温蒸汽处理对-42-植物组织的损伤较小，所以现在多采用高温蒸汽处理。进行热处理时，最重要的是严格控制温度和处理时间。

(2)高温空气处理

对于处理过的植株，通常是将被病毒感染的整株幼苗进行盆栽，因为用于热处理的病株，病害组织越小，解毒效果越高。但新移栽苗的根系耐热性较差，一般移栽后用上盆1年左右的苗处理。粘土花盆耐热性好，热处理时根部温度会下降几度，所以推荐使用粘土花盆。因此，对柑橘、苹果的热处理，采用脱毒种砧木芽对病穗进行芽接，接芽后一周开始热处理，解毒效果好。目前有多种热处理装置，小的只有11英尺，大的可以进入内部作业，可用于大量试验材料的热处理。为了调节湿度，还应安装加湿器。虽然高温空气处理不像温汤处理那样需要病毒灭活温度与植物体能耐受的温度重合，但温度和相关条件也必须精确。

热处理温度因病毒种类而异。有些病毒在3334的条件下可以解毒，而有些病毒则必须在3942的条件下才能解毒。在生产实践中，一般采用35-381恒温，381恒温的例子很多。例如，苹果在371的恒温条件下热处理2830天，对褪绿叶斑病毒、茎痘病毒和茎沟病毒的平均脱毒率为26.5%。

许多案例证明，变温热处理的解毒效果优于恒温热处理。近年来，为减少高温对植物体的伤害，有的情况改用40~45^白天：处理12~16h，30~35^夜间：处理8~12h

在生产实践中，白天^加工^匕首，晚上30加工8把匕首的例子居多。但也不能一概而论。作为柑橘速腐苗黄化株，在38恒温条件下处理8周不能脱毒，必须处理12周才能脱毒；否则，白天40，晚上30，8周即可解毒。柑橘叶叶病毒3816周不能解毒，白天40，晚上30。 301治疗6周，白天441，晚上301治疗2周，但排毒成功。

在进行热处理解毒时，还应控制好相对湿度和光照。通常相对湿度应保持在70^~80*之间。在过度干燥的条件下，热处理过的枝条生长不好。自然光是最好的光照，但秋冬季节可适当补充人造光，对新梢的伸长有很好的效果。有的病例可用日光灯和白灯照明161解毒。

为了提高植物的耐热性，延长植物在热处理中的存活时间，往往在热处理前进行预处理。比如在使用38^之前：热处理，先在27~351处加工1~351

植物体的耐热性与植物体各部分组织中的碳水化合物的 含量成正相关，因此，应在植物组织成熟的季节进行 热处理。

用热处理脱毒法培育无病毒个体时，通常是剪取苗木在 热处理中伸长出的新梢顶端嫩枝，将其嫁接到无病毒实生砧 木上。若是用新梢停止生长的苗进行热处理时，可剪取已硬 化的枝条，直接嫁接到砧木上。对于葡萄，剪取热处理中伸 长新梢或副梢的顶端部分，长约1〜5。1，扦插在珍珠岩等 适宜的保湿扦插床中，不久即发根，一个月后即可移植。如 果用此法不能获得无病毒个体时，就必须剪取新梢顶端更短的部分。

二、茎尖培养脱毒

(―)概述

病毒侵入植物体后，一般具有系统侵染性，也即具有全 身扩展的特性，但不同的组织和部位，病毒的分布和浓度有 很大差异，甚至有的组织或部位尚无病毒。植物感染病毒后 不含有病毒的部位，对病毒的防治具有重要的意义。例如， 大多数植物的种子不带病毒，因此可以自然获得无病毒后 代。除种子之外生长点附近，即茎尖和根尖的分生组织也多 不含有病毒。但不含有病毒的部分是极小的，不超过0. 1〜

0.5mn^这样小的无病毒组织，以往无法繁殖利用。自组织 培养技术发展以来，可以切取这种微小的无病毒组织，用组 织培养技术也可培养成完整的植株。如1934年White用感 染烟草花叶病毒的番茄根和1949年Limasset等用感染烟草 花叶病毒的烟草茎分别进行的研究结果表明，病毒浓度呈梯 度变化，病毒粒子随着植物组织的成熟而增加，顶端组织不 带病毒。Morel等于1952年从感染花叶病毒和斑萎病毒的植 株上，切取茎尖组织进行培养，成功地获得无病毒的大丽 花。目前，茎尖培养在草本植物上应用较多，而在木本植物 上应用甚少。这项技术在番木瓜、草莓、柑橘和葡萄的脱毒 方面，已获成功并取得初步应用效果。

茎尖培养脱毒程序，一般有以下6个步骤：第一步，材 料处理和接种；第二步，诱导芽分化和小植株的增殖；第三 步，诱导生根；第四步，生根植株的移栽；第五步，移入苗 :第六步，病毒检测。其中分化、增殖、生根3个步骤，

均需要特殊的培养基。在果树苗木茎尖培养中最常使用的是河-

培养基，但各步骤中所需要的植物生长调节剂种类、用量及 配合比例各不相同，并依培养的果树苗木种类而异。脱毒成功机 率与茎尖大小直接相关。对不同的植物，采用大小相同的茎 尖进行培养，脱毒效果主要取决于病毒类型而不是植物种 类。正常茎尖培养时切取的茎尖越小，脱毒率就越高。草莓 切取茎尖为0.2〜0.311^时，脱毒率为100*;切取茎尖为 1.011^时，脱毒率仅为50*。但茎尖过小培养成活率低， 而且操作难度也大。因此，脱毒时要兼顾脱毒率和成活率， 茎尖切取的大小要适中，一般切取长度为0.2~0.50^，带 有1〜2个叶原基的茎尖作为培养材料。苹果切取0. 1〜

0.211^茎尖培养，脱毒株率为35.0^。其中，苹果褪绿叶 斑病毒的脱毒株率为80.0^，苹果茎痘病毒的为65.0^, 苹果茎沟病毒的为50.0^。在未脱除的病毒中，苹果褪绿 叶斑病毒占19.19^，苹果茎痘病毒占33.3*，苹果茎沟病 毒占47. 6%。

(二）茎尖培养脱毒机制

应用电子显微镜和荧光抗体技术可以明显地看出，在每 一个“植物-病毒”组合中，都存在一*个特殊的顶端免疫 区。这个顶端免疫区决定了无毒茎尖的大小^如果仅最顶端 一个细胞不带病毒，则无毒签尖大小为0.1〜0.3^^;如果 免疫区比较大，则无毒莲尖大小为0.5〜3111^然而，即使 在分生组织细胞中有病毒粒子，培育无病毒苗也是可能的。 对此已提出多种解释，如：正常的或病毒的核蛋白合成之间 的营养竞争、酚胺抑制剂的存在和因切取茎尖时细胞受伤而 引起的代谢破坏。虽然这些假设中没有一种令人十分信服的 解释，然而，这些假设却很好地说明了较小的茎尖对于脱毒是最重要的。

(三）应用

茎尖培养获得的小幼株，可离体培养得到分生单系。要 尽可能快地对每一个分生单系的2株或3株小幼株进行鉴 定，确定是否还带病毒。在确定分生单系是否不带病毒之 前，需多次重复这些实验。在有条件的单位，可用酶联免疫 吸附检测法代替指示植物进行这种鉴定。由此而获得的无病 毒分生单系，通过腋生分枝快速繁殖，可在短期内给生产单 位提供无病毒试管苗。

通常情况下，无病毒苗是保存在黑暗、低温的条件下， 在此条件下，无病毒苗可在试管中保存很长时间。如木本果 树的试验结果是，切除在繁殖培养基上伸长生长茎的所有叶 片，再把茎浸渍在基本培养基中，然后把试管放在冰箱中， 结果5年后，这些枝条在新鲜培养基上仍能增殖。