草菇菌种的提纯复壮初探

菌种的分离筛选是食用菌栽培过程中的重中之重。食用菌菌种在使用过程中会发生变异和退化，尤其是草菇的菌丝，生长和降解速度都很快。因此，需要定期引进或纯化复壮，以保证菌种的质量和稳定性，从而保证最终的产量。稳定奠定基础。 1、组织分离在草菇工厂化生产中，为保证品种的稳定性，大多采用定期组织分离、严格筛选的方式获得菌种。一般每次选择种菇，首先要选择出菇好（产量高、整体菇形适中、均匀度高）、菇房内无明显病虫害的菇房；其次，选择最好的蘑菇屋从床架上，选择最适合蘑菇的材料层；从材料层上最好的一层蘑菇中，挑选嫩草菇（5个半熟，呈小桃形）3到4个。摘下嫩草菇立即放入消毒过的或干净的塑料袋中，带与试管培养基一起送至菌种室的超净工作台进行分离。组织分离时，先用75%的消毒酒精对手、工具和蘑菇表面进行消毒（有经验的操作者可能不会对蘑菇表面进行消毒），然后用烧焦充分的手术刀在蘑菇表面做一个浅圆形切口纵面（不要切开外层菌帘），在种菇基部从中间剪一个小口，捏住种菇外侧剥去菇蕾，在菇体连接处浅切帽盖和菇柄用消毒冷却的手术刀呈“田”字形，每小块3-4mm见方（尽量不要切破菇肉触及鳃），直接将小块菇肉插入用刀夹试管培养基，用棉塞塞住。将菌肉小块轻拍至试管底部，置于29-31环境中培养。分离出的试管应达到24个左右，如因操作失误达不到，应补充合格的种菇，重新分离。 2 分离菌种的鉴定与筛选2.1 初步筛选1 一般经过3天左右的分离培养后，菌肉会长出白色菌丝。当丝长到2cm左右时，观察菌丝的生长情况： a基部菌丝整齐致密，细长而结实，呈银灰色，生长速度快；内层菌丝很稀疏，气生菌丝生长混乱，气生菌丝发白，气生菌丝比内苗多或感染杂菌，只要出现其中一种情况，就会被清除； 观察满管速度，记下满管时间； 观察厚垣孢子出现的时间早晚；选择先满的、先出现厚垣孢子的试管，保留最好的12株，不足的尽量保留。 2.2 初步筛选2 将剩余的12株菌株编号为VZ1~VZ12，取顶端菌丝转移至试管中，保持底部3cm不动，每管转移20~30个试管，并相应标记为VZlMI~VZ12M1； 管转移后剩余的菌种，在酒精灯下，打碎试管底部（可以用小砂轮在底部没有介质的地方打个记号，然后放在火焰上烤一会儿.如果没有破裂，用冷酒精棉球快速冷却将试管底部弄破），用消毒过的打孔器在底部打样品1-2cm（打孔器直径为4-5mm） ，打2排孔，每排2个孔；靠近底座的一排连接到板的中心，另一排排列到板的边缘；菌丝体表面的培养基，标记与转移管试管相同，置于29-31倒置培养； 转管试管筛选方法同下文“草菇母种转管筛选”；平板分为2块：连接中心的菌株主要比较菌丝形状、颜色、均匀度、是否有角度变化，剔除不稳定菌株；边缘连接的菌株主要比较各组的平均生长速度，如果平盖板上没有凝结水的，比较爬壁能力；经过综合评价，选出最好的8株。 2.3 复筛厚垣孢子出现后，将筛选出的8株试管置于20避光保存； 从8个菌株中挑出最好的1-2个平板接种原种，置于距接种块2cm处。取样采用打孔方式，每个样品接1袋原种，菌丝体表面附着在物料表面。每株取30袋，29-31避光培养，记录其生长速度，观察菌丝颜色及生长情况（原种子培养基必须按配方准确称量，严格控制材料配比加水，将物料混合均匀，装入袋中（重量、高度、松紧度相同）。

筛选出表现最好的4株，每株取原种20袋，20避光保存5袋，对15袋进行出菇试验。 3 出菇试验出菇试验是所有食用菌选育中最关键的一步。通过出菇试验，比较不同菌株的优缺点，筛选出适合不同菌株的生产模式。草菇组织分离板接种原种，将从外部引进并经转移管筛选的亲本转移至每株30袋原种中；当出现厚垣孢子时，每株选15袋较好的做蘑菇试验。 4株加进口种15袋，每组菌株5袋，3个重复； 沿底角剪去袋底，袋口留2cm，剪掉多余部分，整理在菇床架上； 喷出菇水：出菇水的温度和PH值与普通出菇水相同。总水量约为原种子干重的30%。调整情况，让底部不滴水，少而不多，防止因水分过多导致产量大幅减产。 出芽、出菇管理同常规。采收时记录采收时间和各组采菇重量，记录重量。统计分析时，每组去掉1袋最差的，比较平均生物转化率、开始出菇时间和清床时间；保留生物转化率最高、转化周期最短的2株菌株；淘汰菌株对应的保藏原种停止贮藏，保留2株对应的保藏原种在品种生产有效期内轮作栽培。 4 草菇母种转管筛选转管前种源在29-31培养24-48小时。转管时，保证空白斜面无结露，接种块尺寸一致，规格为3mm3mm4mm4mm，菌种直接落底，不要划伤培养基，29-31避光培养。 接种后24小时，观察发芽情况，正常发芽12小时； 接种后48小时，观察菌丝生长情况：基部a菌丝整齐致密，细长而结实，呈银灰色，生长速度快；气生菌丝具有较强的爬壁能力，并持续均匀生长； b.基部菌丝稀疏，气生菌丝生长杂乱，气生菌丝发白。这种情况应该被消除； c比a稍慢，标记后即可培养（部分种子块在接种时被烫伤，发芽慢造成，后期培养指标合格）

　　注：斜面母种在30d有效保藏期内使用的，对于同一批次同一品种的，优先使用菌丝先长满的；在菌丝同一天长满的里面优先使用先出现厚垣孢子的。

　　5  原种和栽培种的筛选

　　生产原种和栽培种之前，在接种前48h，取出保藏菌种置于29～31℃下恢复培养。

　　原种的筛选标准：以生长速度、菌丝色泽和健壮程度、厚垣孢子出现早晚为基准；采用标准棉子壳配方29～31℃培养，一般48～72h封面，8～10d长满，12～15d出现厚垣孢子，10d内未长满的淘汰；菌丝纤细有力呈银灰色的保留，菌丝变浓白或局部变浓白的的淘汰；由于配方以及含水量的不同，上述参数会有所不同，根据实际情况选择菌丝外观好生长速度快的原种，出现厚垣孢子早的更好。

　　栽培种的筛选与原种基本相同，差异在时间上，一般使用标准配方在29～31℃培养，48h封面，7～10d长满，11～14d出现厚垣孢子，10d内未长满的淘汰。

　　6  菌种保藏期限

　　草菇母种出现厚垣孢子之后立即置于18～22℃环境避光保藏，30d内使用最佳，最长不超过60d，草菇原种出现厚垣孢子之后立即置于18～22℃环境避光保藏，20d内使用；草菇栽培种出现厚垣孢子之后最好立即使用，18～22℃下保藏前3天效果最佳，最多存放7d。

　　注意事项：①在草菇上使用的试管培养基，要注意以下几点：a.培养基在配制至分装前，做到搅拌均匀，防止因试管内营养差异影响对菌丝优劣的判断；b.试管培养基灭菌后冷却、摆斜面时要防止出现大量冷凝水，培养基温度在55～60℃的时候出锅，温度过高冷凝水多，温度过低容易凝固；斜面摆好后要立刻覆盖一些洁净的保温材料，防止凝固时产生大量冷凝水；如果少量定型的斜面存在冷凝水，应剔除；如果大多数试管都产生冷凝水，可在较密闭的干净箱体内放置干燥剂（如生石灰块）对试管进行干燥，待斜面上冷凝水除去后立即停止干燥。②际准草菇菌种配方：棉子壳84%，麸皮12%，轻质碳酸钙2%，生石灰2%，料水比1∶1；灭菌后pH≤6.0。根据棉子壳的质量优劣，酌情添加1%蔗糖。③周期的安排：在各个环节都稳定的情况下，一般组织分离、出菇试验90d做一次，如果出现高产菇房，立即做组织分离和出菇试验。一次组织分离到出菇试验结束需要40d，每次接试管到出现厚垣孢子需要7～10d，每次转管出现厚垣孢子保藏20d需要进行下1次转管（每次转管的尽量在保藏1个月内使用），允许转管3次。（王志强）